硒(Seleniun,Se)是生命活動(dòng)中必需的微量元素,在人體中以硒蛋白的形式存在,具有提高免疫、抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、解毒和抗輻射等生物與生理功能。人體硒缺乏會(huì)降低硒蛋白的表達(dá)及生物學(xué)功能的正常發(fā)揮,會(huì)引起如貧血、冠心病、高血壓、癌癥等40多種疾病,適量補(bǔ)硒有利于人體健康[1-3]。但硒對(duì)人體的有益生理功能必需控制在安全濃度范圍之內(nèi),補(bǔ)硒過(guò)量又會(huì)引起生物體中毒[4],世界衛(wèi)生組織(WHO)、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)、國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)均規(guī)定了明確指標(biāo):膳食硒的供給量為50~250μg?d-t,成人個(gè)體硒最高安全攝入量為400g?d-1[5]。人體從環(huán)境中攝取硒的主要途徑是食物,食物鏈中硒又主要來(lái)源于植物,因此對(duì)植物硒的準(zhǔn)確測(cè)定顯得十分重要。

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1方法

目前測(cè)定硒的方法主要有光學(xué)分析法(分光光度法、熒光法、原子熒光光譜法,原子吸收法等)6[6-8]、電化學(xué)分析法(陰極溶出伏安法、極譜法等)[9,10]、色譜學(xué)分析法(離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等)[11]、聯(lián)用技術(shù)(電感耦合等離子體質(zhì)譜法)等[12,13],每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn),在不同的情況下可選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法進(jìn)行分析。其中氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)因其測(cè)定硒具有較高的靈敏度和精確度,所用試劑毒性小,操作簡(jiǎn)便,實(shí)用性強(qiáng),已入選食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“食品中硒的測(cè)定(GB5009.93-2010)”的第一法[14]，尤其適合痕量硒的測(cè)定，本工作采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定植物樣品中的硒。

植物硒多以有機(jī)形態(tài)存在，儀器測(cè)定前需轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)離子，目前處理植物樣品的方法有干灰法和濕法消解等方法，鑒于硒的易揮發(fā)特性，植物硒多采用濕法消解。“國(guó)標(biāo)法-食品中硒的測(cè)定(GB 5009.93-2010)”采用兩種濕消解法:硝酸十高氯酸“電熱板”敞開(kāi)體系常壓消解法,硝酸十雙氧水“微波”密閉體系消解法?！半姛岚濉毕鉃閭鹘y(tǒng)濕消解法,簡(jiǎn)便成本低,易操作,但試劑消耗多,溫度不能精確控制,消解時(shí)多憑經(jīng)驗(yàn),消解溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)極易造成硒損失,溫度過(guò)低有機(jī)硒又不能完全被消解,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。微波消解是目前被廣為推薦的一種微量元素消解方法,程序控溫,氧化劑用量少,微波消解時(shí)間短且完全,但缺點(diǎn)是微波消解后還需在電熱板上趕走殘留余酸才能確保測(cè)量的準(zhǔn)確性。硒的易揮發(fā)性決定了硒必須低溫趕酸,這一步驟所需時(shí)間較長(zhǎng),總體消化過(guò)程中只是節(jié)省了微波消解部分的時(shí)間,且單個(gè)樣品消化量較少,通常只有0.1~0.5g。本法采用程序控溫的石墨消解儀消解處理植物硒,單個(gè)樣品消化量可達(dá)10.0g以上,可以滿足痕量樣品的大稱樣量的分析要求。石墨消解雖屬于敞開(kāi)體系,但具有微波消解儀相同的自動(dòng)控溫程序,裝有試樣的消解管全部包裹于石墨加熱孔中,能量不易散失,加熱效率高且均勻,消解趕酸能同時(shí)進(jìn)行。且石墨消解管還自帶刻度,消解完成后無(wú)需轉(zhuǎn)移樣液可直接定容,有別于電熱板和微波消解的二次轉(zhuǎn)移重新定容過(guò)程,避免了在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的污染和損失。特別是儀器價(jià)格比微波消解儀低,經(jīng)濟(jì)適用,常規(guī)實(shí)驗(yàn)室都有能力購(gòu)買(mǎi),操作簡(jiǎn)便安全,所用試劑毒性小,一次可處理大批樣品,尤其適合植物樣品批量分析,其測(cè)定結(jié)果令人滿意。

1.2儀器與試劑

DS-360智能石墨消解儀;雙道原子熒光光譜儀,高性能硒空心陰極燈(北京有色金屬研究總院);超純水機(jī),氬氣:純度為99,99%。

硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO)、鹽酸(HCl)均為GR。硼氫化鉀溶液(10.0g?L-1):稱取5.0g氫氧化鉀(KOHAR)溶于約500mL純水中,加入10.0g硼氫化鉀(KBH4CP),緩緩搖動(dòng)使其溶解,定容至1000mL,混勻即可,現(xiàn)配現(xiàn)用。鐵氰化鉀(100g?L-1)溶液:稱取10.0g鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6),AR,溶于100mL純水中,混勻。植物標(biāo)樣為灌木葉(GBW07602/GSV-1)、柑橘葉(GBW10020/GSB-11)、茶葉(GBW10016/GSB7)、圓白菜(GBW10014/GSB-5),大米(GBW10010/GSB-1)分別購(gòu)自地球物理地球化學(xué)勘査硏究所。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶液(100mg?L-1),硒質(zhì)控環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSBZ50031-94(203710)),購(gòu)自中國(guó)環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所。試驗(yàn)中純水為18.3MΩ?cm(25C)超純水。

1.3樣品與測(cè)試液的制備

稱取2.0g(精確至0.0001g)洗凈60C烘干粉碎的植物樣,加入10.0mL硝酸十高氯酸(8+2)(g)混酸及幾粒玻璃珠于100mL刻度消解管中,上端放彎頸玻璃小漏斗便于回流,混勻放置在石墨消解儀的石墨加熱孔中,于通風(fēng)良好的通風(fēng)櫥內(nèi)冷消化過(guò)夜12h后,石墨消解儀會(huì)按預(yù)先設(shè)定的消解程序進(jìn)行升溫消化,升溫程序?yàn)?室溫→50C保持0.5h100C保持1h-→160C保持2h→-180C保持,最后保持時(shí)間視樣品消化情況而定。其間要觀察消化液顏色,若較深,及時(shí)補(bǔ)加硝酸,反復(fù)多次,直到?jīng)]有棕色氮氧化物氣體冒出。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有濃白煙岀現(xiàn)時(shí),繼續(xù)保持180C加熱,其間可加入1~2mL純水1~2次,目的是趕殘余酸,這樣可以解決濕法消解測(cè)定空白高的特點(diǎn),直至加熱消化到剩余體積為2mL左右時(shí),切不可蒸干,取下冷卻至室溫,再加入5.0mL50%HCl(g)于剩余消化液中,再次至于消解儀中升溫至100C(或沸水浴加熱),保持10~15mn,溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙時(shí),逐將Se+還原成Se+。取出冷卻用純水定容至25mL,密封搖勻備用。同時(shí)做試劑空白。

測(cè)試液的制備:按所需稀釋比例吸取以上待測(cè)液的上清液1.0~5,0mL至10mL比色管中,加入適量的50%HCl(g)(以確保定容后的樣液酸度為15%),1.0mL鐵氰化鉀(10gg?L-1)溶液,純水定容并混勻。靜置30min后上機(jī)測(cè)試

1.4硒標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將100mg?L-1硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用5%HCl溶液稀釋至100gg?L標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。從100gg?L硒標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液中,分別移取0.00,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL至7個(gè)50mL容量瓶中,加入少量純水,再分別向每個(gè)容量瓶中加入50%HCl15.0mL(以確保定容后的樣液酸度為15%),5.0mL鐵氰化鉀(100g?L-1)溶液,純水定容,即可得到一組濃度為0.00,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00gg?L-1系列硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

2、結(jié)果與討論

2.1原子熒光光譜儀工作參數(shù)

考慮燈電流、光電倍增管負(fù)高壓、載氣流量和反應(yīng)介質(zhì)等對(duì)分析靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度的影響,結(jié)合AFS-9700型雙道原子熒光光譜儀的儀器條件,經(jīng)反復(fù)試驗(yàn),確定了植物硒測(cè)定的最佳工作參數(shù),特別對(duì)讀數(shù)時(shí)間和延遲時(shí)間進(jìn)行了反復(fù)摸索,最終確定了讀數(shù)時(shí)間為14s,延遲時(shí)間必須為6s時(shí),在儀器的信號(hào)采集單元內(nèi)才能獲得一個(gè)完整正態(tài)峰型,此時(shí)峰面積最大,達(dá)到了最佳積分效果,說(shuō)明在上述儀器工作條件下,硒熒光強(qiáng)度響應(yīng)值最高,結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2消解液用量

準(zhǔn)確稱取2.0mg(精確至0.0001g)植物標(biāo)樣柑橘葉(GBW10020(GSB-11))樣品21份,分3組,每組7次重復(fù)。分別加入混酸比為HNO3+HCl0O4(V+V)=(6+4),(8+2)和(9+1)消解液10.0mL及幾粒玻璃珠冷消解12h過(guò)夜,消解處理制樣步驟同1.3,測(cè)試硒的相對(duì)熒光值,結(jié)果見(jiàn)表2。

可知:混酸比為HNO3+HClO(V+V)=8+2處理的柑橘葉樣品中硒的相對(duì)熒光值最高,且試樣重復(fù)良好,其余兩組熒光值偏低,重復(fù)不穩(wěn)定,特別是混酸比為HNO3+HCIO4(V+V)=6+4一組重復(fù)差異較大。說(shuō)明用HNO3+HCO4(V+V)=8+2混酸比消解處理柑橘葉樣品時(shí),硒的提取最完全。

全植物樣品中含有大量有機(jī)質(zhì),在酸量較少的情況下HClO1遇到大量的有機(jī)物不僅易發(fā)生爆炸,還會(huì)造成空白值偏高。實(shí)驗(yàn)中加入的HClO41分別為4.0,2.0,1.0mL。發(fā)現(xiàn)HClO加入量越多,消化液中HCIO4的殘留量就越多。如果消化至剩余體積的2mL左右時(shí),HCO冒煙時(shí)間過(guò)長(zhǎng),硒有損失,則測(cè)定結(jié)果偏差較大;HClO44加入量少,消解速度慢,時(shí)間過(guò)短,消解液顏色深,有機(jī)質(zhì)消解又不完全。對(duì)于稱樣量為2.0g的柑橘葉樣品來(lái)說(shuō),選擇混酸比HNO3HClO(V+V)=(8+2)mL,,HClO1加入量為2.0mL,就可以使有機(jī)質(zhì)充分消解。當(dāng)稱樣量大時(shí),可以相應(yīng)增加HClO的量,最終消解液中HClO)殘留量約為0.5~1.0mL較為合適。其他實(shí)驗(yàn)條件的影響研究均采用(8十2)混酸比來(lái)消解植物樣品。

2.3消解溫度和消解時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱取2.0g(精確至0.0001g)植物標(biāo)樣茶葉(GBW10016)樣品和灌木葉(GSB07602)樣品各15份,分3組,每組5次重復(fù)稱樣,以2.2中HNO3+HClO4(V+V)(8+2)mL混酸比溶液進(jìn)行消化處理,再以不同的消解溫度進(jìn)行消化處理,測(cè)試硒的相對(duì)熒光值,結(jié)果見(jiàn)表3。

準(zhǔn)確稱取2.0g(精確至0.0001g)植物標(biāo)樣茶葉(GBW10016)樣品和灌木葉(GSB07602)樣品各24份,分8組,每組3次重復(fù)稱樣,以2.2中HNO3+HClO4(V+V)(8+2)mL混酸比溶液,以表3中的160~180C為消化溫度,分別設(shè)定8組消化時(shí)間為2,3,4,5,6,7,8,9h,測(cè)試硒的相對(duì)熒光值,結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表3和圖1可知:消化溫度控制在160~180C之間消化時(shí)間在6~7h之間時(shí),兩種植物樣品硒的提取最完全;當(dāng)消化溫度<160C,或>180C時(shí),消化時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)時(shí),硒消化不徹底或容易揮發(fā),都會(huì)導(dǎo)致熒光值偏低且不穩(wěn)定。

2.4還原劑硼氫化鉀(KBH4)和載流鹽酸(HCI)的影響

在儀器條件不變的情況下,測(cè)試10Hg?L-的Se標(biāo)準(zhǔn)溶液隨載流HCl和還原劑KBH4濃度變化對(duì)硒熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3?？芍?當(dāng)載流HCl和還原劑KBH4濃度低時(shí)熒光強(qiáng)度低,信號(hào)靈敏度差,說(shuō)明還原能力弱;當(dāng)載流HCl和還原劑KBH41濃度增大時(shí),熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng);當(dāng)兩者濃度太高時(shí),反應(yīng)產(chǎn)生的氫氣多,泡沫都易沖入管道,熒光強(qiáng)度反而會(huì)降低,這是由于過(guò)量的氫氣稀釋了火焰中硒原子蒸氣造成的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)于10pg?L1的Se標(biāo)準(zhǔn)溶液,還原劑KBH4濃度在0.8%~2.0%(m/V)之間,載流HC1濃度在4%~15%(g)之間,火焰平穩(wěn),熒光值達(dá)到最大且穩(wěn)定,信噪比和靈敏度最高。綜合考慮選擇還原劑濃度為1.0%KBH4(m/V)+0.5%KOH(m/V),載流HC1為10%(g)。

所配還原劑KBH4溶液要含有一定濃度的KOH以保證溶液的穩(wěn)定性。建議KOH的濃度為0.2%~0.5%(m/V),濃度過(guò)低,KBH4會(huì)分解,濃度過(guò)高則會(huì)影響氧化還原反應(yīng)的總體酸度,離開(kāi)KOH和KBH4的濃度來(lái)討論最佳酸度是毫無(wú)意義的。

2.5樣品酸度(HC的選擇樣

品消化過(guò)程的酸度確保了Se+還原成Se+,上機(jī)測(cè)試前樣品經(jīng)稀釋后制備液酸度也會(huì)影響硒的測(cè)定結(jié)果。分別吸取100gg?L-標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液5.0mL于7個(gè)50mL的具塞比色管中,分別加入0.0,1.5,2.5,5.0,10.0,15.0,20.025,0mL濃HCl,用純水稀釋定容至刻度,用以制備不同酸度的10gg?L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,以2.4中的最佳載流和還原劑濃度進(jìn)行上機(jī)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖4?？芍?扣除空白后,HCl(g)在3%~20%范圍內(nèi),10gg?L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度;當(dāng)樣品HCl(q)>20%時(shí),硒熒光值受到抑制且不穩(wěn)定,考慮到樣品酸度的提高有利于硒的還原,同時(shí)可以減少共存元素的干擾,故本方法選用15%HCl(g)酸度作為樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)試時(shí)制備液的酸度,才能保證測(cè)量的穩(wěn)定性和一致性。

2.6線性方程、檢出限

植物樣品硒的測(cè)定中,標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍無(wú)需很大,本實(shí)驗(yàn)在0~10!g?L-的濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)很好,r=0.9999,回歸方程y=131.67x+203.94;又對(duì)0~100gL-濃度范圍進(jìn)行了測(cè)定,其線性相關(guān)也很好,r=0.9997,回歸方程為y=132.43x+315.13,說(shuō)明本方法不僅靈敏度高,而且線性范圍寬。

在本實(shí)驗(yàn)條件下,連續(xù)測(cè)定空白熒光值11次,并以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以工作曲線的斜率計(jì)算出溶液中硒的檢岀限0.018g?L-1,若以2.0g植物樣品最后定容25mL計(jì)算,樣品檢出限0.225gg?kg-1

2.7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析及回收率和精密度

分別選取灌木葉、大米、圓白菜、茶葉和柑橘葉五種植物標(biāo)準(zhǔn)樣品,每種重復(fù)3次準(zhǔn)確稱取2.0g(精確至0.0001g),按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行消解,測(cè)定本底值。再對(duì)每種植物標(biāo)樣稱取子樣,每種重復(fù)3次準(zhǔn)確稱取2.0g(精確至0.0001g),此次每種試樣中分別加入1.0mg?L-1硒標(biāo)準(zhǔn)溶液150,300,450gL,進(jìn)行消解并測(cè)定加標(biāo)后值,同時(shí)測(cè)定硒質(zhì)控環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSBZ50031-94(203710)),結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn),硒標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)回收率在87.1%~106.2%之間,精密度(n=3)在0.83%~5.69%之間,所測(cè)結(jié)果均與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的參考值吻合,完全達(dá)到分析要求。

3、結(jié)論

采用程序控溫石墨爐消解-氫化物熒光光諧法在本文得到的最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定以柑橘葉、茶葉、灌木葉、圓白菜、大米等為代表的幾種植物樣品中的硒,線性范圍寬、靈敏度高、檢出限低、穩(wěn)定性好的顯著特點(diǎn),尤其適合這類批量植物樣品中硒的痕量分析,且該方法操作簡(jiǎn)便安全,實(shí)用性強(qiáng),儀器成本低,所用試劑毒性小,可作為一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)分析方法。

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